2018,
Vol. 42
在生命体系中, 氧化反应通过金属蛋白酶(如过氧化物酶)的催化作用来实现[1], 该反应在常压、室温和水相中进行, 并且大多数情况下催化活性位点为环境友好的铁元素。大多数催化氧化反应的金属酶活性部位是一个较宽的疏水“口袋”, 用于容纳氯化血红素辅酶和底物。氯化血红素的化学结构为铁(Ⅲ)卟啉, 本身不溶于酸性和中性水溶液, 很容易聚集, 同时在大多数的有机溶液中溶解性也很差。氯化血红素可与各种氧供体化合物(如亚碘酰苯、过氧酸、过氧化氢、烷基氢过氧化物、次氯酸钠、过硫酸氢钾等)发生反应生成Fe(Ⅴ)-O复合体以催化底物氧化[2]。由于过氧化氢是一种溶于水的环境友好型氧化剂, 反应副产物为水, 所以体外模拟研究大多数都使用过氧化氢作为氧原子供体[3-5]。烷基糖苷由脂肪醇和葡萄糖合成, 是一种性能较全面的新型非离子生物表面活性剂, 具有起泡性好、溶解性强、耐强碱和电解质、生物相容性好等特点, 是公认的“绿色”功能性表面活性剂[6-8]。DDM胶束能够很好地溶解和稳定氯化血红素, 形成的复合体系具有类似过氧化酶的催化能力。基于仿生化学与绿色化学的理念, 笔者采用烷基糖苷类非离子表面活性剂十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM), 利用它在水溶液中形成稳定、中心疏水的胶束结构, 构建其与氯化血红素形成的复合胶团, 考察该体系的催化氧化性能，并测定其相关反应动力学常数, 探讨反应机制。
1 实验 1.1 试剂和仪器试剂:氯化血红素(hemin), Frontier Scientific生产; 十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM), SIGMA生产; 过氧化氢(H2O2), 国药集团化学试剂有限公司生产; 酸性橙(Orange Ⅱ), 北京百灵威科技有限公司生产。
仪器:动态光散射仪; 紫外可见分光光度计, 附恒温水浴锅; 吸光度均用10mm比色皿; HI8424便携式防水pH酸度计(哈纳沃德仪器(北京)有限公司); KQ-100KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2 试验方法 1.2.1 氯化血红素母液的配置含10% DDM的1 mmol/L氯化血红素母液:用1 mL浓度为20 mmol/L氢氧化钠(NaOH)溶液溶解0.652 mg氯化血红素和0.1 gDDM, 超声10 min混匀, 使氯化血红素更好的分散, 并放于4 ℃冰箱中贮存, 如图 1所示, 用于后续实验。实验时将母液用不同pH值的10 mmol/LPBS缓冲液进行稀释, 所得溶液pH值不会因氯化血红素溶液中氢氧化钠的存在而发生变化。不含DDM的氯化血红素母液:直接用20 mmol/L氢氧化钠溶液溶解0.652 mg氯化血红素, 实验时再用PBS缓冲液进行稀释。
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图 1 氯化血红素-DDM复合体的结构和催化过程 Fig.1 Structure of hemin-DDM complex and catalytic process |
分别利用动态光散射仪和紫外可见分光光度计对氯化血红素和氯化血红素-DDM复合体系进行分析与比较。利用动态光散射仪测定氯化血红素与氯化血红素-DDM复合胶团的水力直径分布, 参数设定时将测定类型设为粒径, 分散剂选定为水, 温度设置为25 ℃, 平衡时间为120 s, 池子型号选用ZEN2112。首先测得含DDM的PBS缓冲液的水力直径分布并作为空白对照, 然后用PBS缓冲液(pH值为7)稀释氯化血红素和氯化血红素-DDM复合体系至终浓度为150 μmol/L, 再使用动态光散射仪表征和对比两种溶液的水力直径分布情况。
为进一步验证氯化血红素的分散情况, 实验用pH值为7.0的PBS缓冲液将氯化血红素和氯化血红素-DDM复合体系稀释到浓度为25 μmol/L, 然后通过测定其紫外可见吸收光谱进行分散情况分析。同时, 作为对照实验, 用氢氧化钠溶液将氯化血红素母液稀释到25 μmol/L, 并记录氯化血红素其其紫外可见吸收光谱。
1.2.3 催化动力学在催化剂的作用下, 酸性橙会被过氧化氢快速氧化降解(图 2)。氯化血红素在不同的pH值和温度下, 将0.25 mmol/L的酸性橙溶液, 6.85 mmol/L的H2O2溶液和不同浓度的氯化血红素溶液以相同体积混合。酸性橙在紫外可见分光光度计上的特征吸收峰在509 nm处。催化反应动力学实验过程中, 记录酸性橙509 nm处吸光度随时间的变化。分别配置pH值为5、6、7、8的PBS缓冲液, 并用不同pH值的PBS缓冲液分别稀释氯化血红素母液, 使其达到所需的浓度及pH值。温度的控制则通过与分光光度计配套的循环恒温水浴来实现。
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图 2 酸性橙被过氧化氢氧化降解过程 Fig.2 Degradation of Orange Ⅱ by H2O2 with hemin-DDM as a catalyst |
研究氯化血红素对底物的催化的动力学参数时, 通过固定一个底物浓度和同时改变另一个底物浓度, 测定酸性橙的降解过程, 并根据Linerweaver-Burk模型拟合求得相应参数。固定酸性橙浓度为0.25 mmol/L, 设置过氧化氢浓度梯度(1、2、4、8、16 mmol/L), 催化剂氯化血红素浓度为150 μmol/L, 测得反应动力学; 同理, 固定过氧化氢浓度为6.85 mmol/L, 设置酸性橙浓度梯度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 mmol/L), 催化剂氯化血红素浓度为150 μmol/L, 测得反应动力学。
首先通过测定一系列不同温度下酸性橙在509 nm处的吸光系数并取平均, 获得可靠的的摩尔吸光系数(ε509 nm)。反应的初速度可通过以下方程求得:
| $ \Delta c = \Delta {f_{{\rm{abs}}}}/\left( {\varepsilon b} \right), v = \Delta c/\Delta t. $ |
式中, fabs为吸收峰的强度; ε为摩尔吸光系数; b为光程(光透过池子的厚度); c为底物浓度; t为时间; v为初速率。
米氏常数(Km)和最大反应速率(vmax)通过Linerweaver-Burk模型计算得到。Linerweaver-Burk模型是米氏方程通过取双倒数所得。实验得到的数据通过以下方程进行分析:
| $ \frac{1}{v} = {K_{\rm{m}}}/{v_{\max }}\left( {\frac{1}{S} + \frac{1}{{{K_{\rm{m}}}}}} \right). $ |
式中, S为底物浓度。
测出不同底物浓度下的初速率, 然后Km和vmax可以通过直线拟合v和S的倒数来获得。
根据前期探索实验, 催化反应均在60 min内基本完成, 通过以下方程求得不同条件下反应60 min后的转化率, 并进行比较分析:
| $ y = \left( {{A_0}-{A_{60}}} \right)/{A_0}. $ |
式中, A0为0时刻酸性橙的吸光度; A60为反应60 min后的吸光度。
2 结果分析 2.1 氯化血红素-DDM复合体系表征氯化血红素非常难溶于酸性和中性介质中, 同时在大多数有机溶剂中的溶解性也很差。由于氯化血红素有两个羧基, 在碱性溶液中通常会有相对好的溶解性。分别配置氯化血红素的NaOH水溶液(氯化血红素浓度为1 mmol/L)和含10%DDM的氯化血红素的NaOH溶液(1 mmol/L), 用PBS缓冲液(pH值为7)稀释至氯化血红素终浓度为150 μmol/L, 使用动态光散射仪表征和对比了2种情况下, 氯化血红素的水力直径分布情况, 以反映DDM胶束对氯化血红素的分散和稳定能力。作为对照实验, 同时表征了10% DDM溶液的水力直径分布。结果见图 3。
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图 3 不同体系水力直径分布 Fig.3 Comparsion of different system' hydrodynamic diameter distribution |
图 3(a)为10%DDM溶液的水力直径分布情况, 图 3(b)为在表面活性剂DDM存在情况下, 将氯化血红素-DDM用PBS缓冲液(pH值为7)稀释后的水力直径分布结果; 图 3(c)为在没有表面活性剂存在的情况下, 将氯化血红素母液用PBS缓冲液(pH值为7)稀释后的水力直径分布结果。动态光散射仪结果显示, DDM胶束的平均水力直径约为5.1 nm, 氯化血红素-DDM复合体的平均水力直径约为5.5 nm, 而氯化血红素的平均水力直径约为7.3 nm。这表明DDM胶束对氯化血红素有很好的分散和稳定效果, 并形成复合胶团, 而且插入氯化血红素后对DDM胶束的尺寸影响不大。
为进一步验证氯化血红素在DDM胶束中有很好的分散性, 采用紫外可见分光光谱进行比较分析。图 4为25 μmol/L氯化血红素的氢氧化钠溶液、氯化血红素和氯化血红素-DDM在PBS缓冲液(pH值为7)中的紫外可见光谱。可以看出, 25 μmol/L氯化血红素在氢氧化钠溶液中有一个390 nm的特征峰和一个360 nm的肩峰; 而25 μmol/L氯化血红素溶于PBS缓冲液中有一个370 nm的特征峰, 表明同时有氯化血红素二聚体(通过μ-氧桥键连接)和单体氯化血红素氢氧化物存在。μ-氧化二聚体对氯化血红素在水溶液中的影响非常大, 并进一步影响氯化血红素的催化活性[9-10]。氯化血红素-DDM溶液在404 nm处有吸收峰, 为氯化血红素单体的特征峰, 同时伴有一个365 nm的肩峰。这表明DDM形成的胶束将氯化血红素包裹在里面, 同时由于疏水相互作用力, 氯化血红素在DDM中多以单体的形式存在。由此看出:无表面活性剂存在下氯化血红素多以二聚体的形式存在于水溶液中; 在氯化血红素-DDM复合胶团中氯化血红素多以单体形式存在并伴有少量的氯化血红素二聚体[11]。
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图 4 体系的紫外可见吸收光谱 Fig.4 UV-vis spectra of systems |
氯化血红素-DDM复合胶团的活性通过酸性橙和过氧化氢作为底物进行评估。酸性橙有最简单的偶氮染料结构, 并被用来作为一种模式染料用来检测生物和化学处理[12]。在过氧化氢酶作为催化剂的条件下, 偶氮结构能被过氧化氢破坏[13]。酸性橙降解引起的吸光度降低通过紫外可见分光光度计在509 nm处被检测。图 5(a)为紫外可见光谱随反应的变化。在过氧化氢、酸性橙和氯化血红素-DDM复合胶团共存时, 在509 nm处的吸收光谱降低, 该现象表明酸性橙的氧化; 而在无氧化剂存在下, 以PBS缓冲液代替过氧化氢溶液进行体系混合, 发现氯化血红素的吸收则不会影响酸性橙509 nm处的吸收。
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图 5 血红素的催化活性与温度、pH值和血红素浓度的关系 Fig.5 Relations of catalytic activity of temperature, pH value and hemin concentration |
酶的活性依赖于底物和反应条件。因此, 氯化血红素-DDM复合胶团的催化活性可能依赖于pH值, 温度, 氯化血红素浓度和底物浓度。首先通过不同温度下酸性橙的摩尔吸光系数, 求得酸性橙的平均摩尔吸光系数为16.3 L/(mmol·cm)(表 1), 通过其特征性吸收峰的强度变化可以换算成底物浓度的变化, 并进一步求得催化反应动力学参数。催化反应活性通过2个参数确定:初速率(v)和1 h内的转化率(y)。由图 5(b)~(d)看出:当温度在50 ℃及以下, 氯化血红素-DDM复合胶团的催化氧化速率要高于氯化血红素; 当pH值小于8, 氯化血红素-DDM复合胶团的催化氧化速率均高于氯化血红素; 催化氧化速率依赖于催化剂的浓度, 浓度越高, 催化氧化速率越快; 在150 μmol/L及其以下的浓度时, 氯化血红素-DDM复合胶团均比氯化血红素的催化氧化速率快。
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表 1 不同温度下酸性橙的摩尔吸光系数 Table 1 Molar absorption coefficient of Orange Ⅱ in different temperature |
图 6表明:氯化血红素-DDM复合胶团和氯化血红素的转化率都随温度的增加而增加, 氯化血红素-DDM复合胶团对温度的敏感性更大一些, 而氯化血红素的敏感性相对较小一些; 氯化血红素-DDM复合胶团和氯化血红素对pH值都有一定的敏感性, 并且氯化血红素敏感性更大一些; 在pH值为8时, 氯化血红素的转化率超过氯化血红素-DDM复合胶团的转化率, 这是由于氯化血红素在碱性条件下更容易溶解, 不易形成二聚体, 氯化血红素单体能更好的稳定住, 从而导致转化率的提高; 氯化血红素-DDM复合胶团与氯化血红素对浓度的敏感性较小, 在较低浓度与较高浓度的时候, 氯化血红素-DDM复合胶团与氯化血红素的转化率都出现了无规律的增大和降低现象, 可能的原因是氯化血红素在浓度过低或者过高的时候不稳定, 易发生其他反应。整体来讲, 氯化血红素催化反应的转化效率很低, 推测原因如下:①氯化血红素在催化氧化过程中出现自氧化现象, 从而导致转化效率的降低; ②氯化血红素-DDM在催化过程中与底物不能很好地结合, 并且生成的产物不易扩散出胶束, 最终导致转化率低。由此可知, 氯化血红素-DDM复合胶团的催化活性受温度的影响比氯化血红素大, 受pH值和浓度的影响与氯化血红素相差不大, 这表现出氯化血红素-DDM对环境条件的变化能有更好的抵抗性。
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图 6 氯化血红素和氯化血红素-DDM复合胶团催化酸性橙氧化反应的转化率 Fig.6 Conversions of degradation reaction catalyzed by hemin and hemin-DDM micelle |
考察底物对氯化血红素和氯化血红素-DDM复合胶团的催化性能的影响。通过改变实验中酸性橙和过氧化氢的浓度, 确定过氧化物类似酶氯化血红素和氯化血红素-DDM复合胶团的催化反应动力学参数, 结果见图 7。由图 7可求得Km和vmax(表 2)。
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图 7 氯化血红素和氯化血红素-DDM催化反应的Km和vmax Fig.7 Measurement of Km and vmax of reactions catalyzed by hemin and hemin-DDM |
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表 2 氯化血红素和氯化血红素-DDM复合胶团的Km和vmax Table 2 Km and vmax of hemin and hemin-DDM |
催化体系与底物之间Km越小, 两者之间的吸附力就越强, 进而表明催化剂有更高的催化效率。从表 2看出, 氯化血红素以酸性橙为底物的Km值比氯化血红素-DDM复合胶团的值大一些, 而以过氧化氢为底物的Km要小。原因是酸性橙具有苯环结构, 这种结构导致了其具有一定的疏水性, 使其能很好地进入到DDM胶团中与氯化血红素进行反应, 所以氯化血红素-DDM复合胶团以酸性橙为底物的Km值较小, 酸性橙与氯化血红素的结合力较强; 而过氧化氢是易溶于水的液体, 亲水性很强, 导致其不容易进入到DDM疏水腔体里面, 进而影响氯化血红素与过氧化氢的结合与反应, 因此氯化血红素-DDM复合胶团以过氧化氢为底物时的Km值较大, 过氧化氢与氯化血红素的结合力较弱。而以最大反应速率作为比较来看, 氯化血红素-DDM复合胶团以酸性橙作为底物时的最大反应速率稍大于氯化血红素的最大反应速率, 而以过氧化氢为底物时的最大反应速率就远大于氯化血红素的最大反应速率。综上所述, 氯化血红素-DDM复合胶团跟底物有较好的结合力, 并且催化效率高。
3 结论(1) 在表面活性剂DDM存在的条件下, DDM所形成的两性胶束能够很好地包裹住氯化血红素, 使氯化血红素与DDM胶束能够形成氯化血红素-DDM复合胶团, 进而对氯化血红素起到很好的分散性和溶解性的效果, 氯化血红素颗粒分散比较好, 单体存在比较均匀分散, 能更好更稳定的储存。
(2) 氯化血红素-DDM复合胶团与氯化血红素纯溶液相比的优势在于氯化血红素-DDM复合胶团更加稳定, 氯化血红素处于胶束的疏水腔中不易形成二聚体, 更易于储存。
(3) 氯化血红素-DDM复合胶团在对温度和浓度的敏感性较大, 对pH值的敏感性较小, 这有利于氯化血红素-DDM复合胶团在各种环境中发挥催化氧化反应。
(4) 氯化血红素-DDM复合胶团跟底物有很好的结合力, 并且催化效率高。
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